• 【發(fā)布單位】衛(wèi)生部
• 【發(fā)布文號】衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2005〕497號
• 【發(fā)布日期】2005-12-14
• 【生效日期】2005-12-14
• 【失效日期】--
• 【文件來源】衛(wèi)生部
• 【所屬類別】政策參考

炭疽病診斷治療與處置方案（2005年版）

炭疽病診斷治療與處置方案（2005年版）

(衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2005〕497號)





各省,、自治區(qū),、直轄市衛(wèi)生廳局，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團衛(wèi)生局：



 為有效應(yīng)對可能發(fā)生的突發(fā)公共衛(wèi)生事件,，更好地指導(dǎo)醫(yī)務(wù)人員開展醫(yī)療救治工作,，我部委托中華醫(yī)學(xué)會組織制定了《炭疽病診斷治療與處置方案（2005年版）》。現(xiàn)印發(fā)給你們,，請在處置相關(guān)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時遵照執(zhí)行,。



 二OO五年十二月十四日





附件：炭疽病診斷治療與處置方案（2005年版）



 炭疽（anthrax）是炭疽桿菌(Bacillus anthracis)引起的動物源性傳染病。炭疽桿菌主要從皮膚侵入引起皮膚炭疽,，使皮膚形成焦痂潰瘍與周圍膿腫和毒血癥,，也可引起吸入性炭疽或胃腸炭疽,，均可并發(fā)敗血癥。炭疽桿菌有可能作為生物武器被恐怖分子所利用,，因而近年來得到國際社會的普遍關(guān)注,。



 病原學(xué)



 炭疽桿菌是形體最大的革蘭氏陽性桿菌，大小1～1.5 ′ 3～5 μm,，兩端平截,，呈鏈狀排列，鏡下形態(tài)呈竹節(jié)狀（圖1）,，鏈的長短因菌株和細菌所在環(huán)境而異,。在人體、動物體內(nèi)或特定環(huán)境條件下（于碳酸鹽瓊脂培養(yǎng)基上于5%～25% CO2下培養(yǎng)）,，該菌可形成莢膜（圖2）,，印度墨汁染色可見桿菌周圍的透明環(huán)，堿性美藍染色莢膜呈紅色（圖3）,。在體外環(huán)境下可形成芽胞（圖2）,，未游離的芽胞在菌體中央。此菌無鞭毛,，不運動,。

 該菌在普通培養(yǎng)基生長良好，最適培養(yǎng)溫度為35℃～37℃,，普通孵箱培養(yǎng)和CO2 孵箱培養(yǎng)均可,，在厭氧條件下也能生長。普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成的菌落為粗糙型,，表面濕潤,，呈獅子頭狀，有的菌株在菌落一側(cè)形成尾突（圖4）,。于血瓊脂平板上培養(yǎng)15～24 h,，分離較好的菌落直徑為 2～5 mm，扁平和微突起的菌落呈不規(guī)則圓形,，邊緣為波浪狀,，表面光滑。培養(yǎng)物為黏性,，當用接種環(huán)挑取時會形成立起的尾狀突起（圖5）,。炭疽桿菌不造成β-溶血（圖6），但在長時間融合,，過度生長區(qū)可能見到微弱溶血現(xiàn)象,，不能與β-溶血混淆。低倍顯微鏡下菌落邊緣呈卷發(fā)樣，稱為獅頭樣菌落（圖4）,。該菌在純培養(yǎng)菌接種肉湯培養(yǎng)的基培養(yǎng)特征為絮狀沉淀生長,，肉湯培養(yǎng)基不混濁。



 圖1 在血瓊脂平板上炭疽桿菌革蘭氏染色

 （放大1000倍）



 圖2 炭疽桿菌

 左圖為帶芽胞炭疽桿菌,，革蘭氏染色（′1000）,；右圖為游離芽胞，為孔雀綠染色,。



 圖3 炭疽桿菌感染動物臟器壓片

 炭疽桿菌排列竹節(jié)狀,，美藍染色，莢膜為粉紅色,，菌體為藍色,。



 圖4 炭疽桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上過夜培養(yǎng)后形成的菌落形態(tài)

 左圖，表面粗糙,、有尾狀突出部分,；右圖為典型的“獅子頭”樣菌落，呈卷發(fā)樣（′100）,。





 圖5 炭疽桿菌在血瓊脂平板上形成的黏性菌落





 圖6 炭疽桿菌（右側(cè)）和臘腸樣芽胞桿菌（左側(cè)）



 炭疽桿菌生化反應(yīng)不活躍,，卵黃反應(yīng)、硝酸鹽還原和明膠液化以及觸酶均為陽性,，不分解淀粉和甘露醇,。抗原結(jié)構(gòu)可分為兩大組,，即菌體抗原和外毒素,。菌體抗原包括莢膜多肽和菌體多糖。莢膜具有抗吞噬作用,，與毒力有關(guān)，細菌變異不形成莢膜時,，致病性也隨之消失,。多糖抗原與毒力無關(guān)。外毒素復(fù)合物由水腫因子,、致死因子和保護性抗原組成,。

 特異性裂解炭疽桿菌g噬菌體可用于該菌的鑒定。但不同來源的菌株對該噬菌體的敏感性不同,，極少數(shù)臘樣芽胞桿菌對該噬菌體敏感（如ATCC4342株）,，也發(fā)現(xiàn)缺失兩個毒力質(zhì)粒的菌株對該噬菌體不敏感（如CDC680株）。在進行噬菌體裂解鑒定細菌時,，應(yīng)采用分區(qū)劃線接種法,，在第一、二區(qū)滴加一定濃度的噬菌體。具有兩個毒力質(zhì)粒的強毒株比較敏感,，在平板上第一,、二區(qū)均可見到裂菌的透明環(huán)，但第二區(qū)更明顯,；缺乏pX01質(zhì)粒的菌株在第一,、二區(qū)均可見較大透明裂菌環(huán)；而缺乏pX02質(zhì)粒的Sterne株在第一區(qū)形成更加透明的裂菌環(huán),。這種現(xiàn)象與質(zhì)粒的有無并無直接關(guān)系,，試驗證實，具有pX01質(zhì)粒的菌株在血瓊脂平板上生長18～20h,，比缺失該質(zhì)粒的菌株可形成更多數(shù)量的芽胞,，因此，具有pX01質(zhì)粒的菌株在普通培養(yǎng)平板上生長時,，形成大量芽胞,，產(chǎn)生大量細胞碎片，當噬菌體加入時,，會與細胞碎片上的受體結(jié)合而失活,；反之，當噬菌體加入缺失pX01質(zhì)粒的菌株生長物時,，大部分噬菌體會感染細菌,，使之裂解。

 炭疽桿菌繁殖力,、抵抗力與一般細菌相同,，但芽胞抵抗力較強。常規(guī)消毒劑如石炭酸,、煤酚水,、新潔爾滅等季銨鹽類消毒效果較差；過氧乙酸,、甲醛,、環(huán)氧乙烷、0.1%碘液和含氯制劑殺芽胞效果較好,。高壓121℃30min,，干熱140℃ 3h可殺死芽胞。炭疽桿菌對青霉素敏感,，培養(yǎng)試驗10U/ml即可抑制細菌生長,，對鏈霉素、四環(huán)素,、卡那霉素也都敏感,。





 流行病學(xué)



 人類主要經(jīng)接觸牲畜的毛皮和肉類獲得感染,，食肉動物也可從食草動物獲得感染，并輾轉(zhuǎn)感染人類,。與牲畜接觸頻繁的人如牧民,、獸醫(yī)和屠宰工人的感染機會較多。被炭疽桿菌污染的毛,、皮進入加工企業(yè),，或感染的肉類進入市場，也可能造成暴發(fā)流行,。

 人類感染炭疽桿菌主要通過接觸途徑,，以皮膚炭疽最為常見。通常散發(fā),，病死率不高,，可以徹底治愈，部分甚至能夠自愈,。但是,，由于嚴重污染造成的吸入感染，或感染牲畜的肉類引起的食入感染,，可能造成吸入性炭疽及胃腸炭疽的暴發(fā)流行,，病死率甚高。嚴重感染者有時發(fā)生炭疽性腦膜炎,。

 炭疽在我國普遍存在,，歷年來發(fā)病數(shù)波動不大，全國的發(fā)病數(shù)在數(shù)百至千余例范圍內(nèi),。高發(fā)的省區(qū)較為固定,，在過去的5年中排序為：貴州、新疆,、甘肅,、四川和廣西。有幾方面的原因造成這些省區(qū)的高發(fā)：畜牧業(yè)的發(fā)展,，群眾屠宰病畜的習(xí)慣,，這些都造成土壤污染面積的增加。此外,，診斷率還與醫(yī)務(wù)人員對本病的警覺性有關(guān)。

 炭疽的診斷時往往需要流行病學(xué)證據(jù)的支持,，但由于炭疽桿菌在自然界存在時間非常長,，這種流行病學(xué)證據(jù)有時難以獲得。特別是在診斷皮膚炭疽時,，不應(yīng)要求必須具備流行病學(xué)證據(jù),。在受到炭疽桿菌作為生物武器的襲擊情況下,，炭疽的流行病學(xué)可能與和平條件下完全不同。





 病理學(xué)及發(fā)病機理



 一,、炭疽發(fā)病機理

 炭疽桿菌的致病性與其產(chǎn)生的外毒素和多肽莢膜有關(guān),，二者分別由2個質(zhì)粒（pX01及pX02）編碼。莢膜有抗吞噬作用,，pX02缺失的菌株不能形成莢膜則易被白細胞吞噬并殺死,，因而沒有致病作用。

 炭疽桿菌的外毒素由3個蛋白組成：保護性抗原（PA）, 致死因子（LF）和水腫因子（EF）,。PA結(jié)合于細胞表面受體,，作為另兩因子的結(jié)合位點。二者一旦結(jié)合,，PA受體復(fù)合物就會促進LF和EF進入細胞內(nèi),。LF和PA結(jié)合形成致死毒素（LT），EF和PA結(jié)合形成水腫毒素（ET）,。LT在細胞內(nèi)使主要的絲裂素蛋白活化激酶失活,。干擾細胞內(nèi)信息傳導(dǎo)，釋放氧自由基及前炎癥細胞因子,，引起細胞死亡,，并破壞血管屏障。ET作為一個鈣調(diào)蛋白依賴性腺苷環(huán)化酶可導(dǎo)致細胞內(nèi)cAMP水平的急劇增加,，導(dǎo)致平衡破壞,，抑制中性粒細胞，使人體對炭疽桿菌更加敏感,，致局部受染,，并發(fā)生水腫。這2個毒素和毒血癥狀有關(guān),，嚴重時可導(dǎo)致多器官衰竭死亡,。

 炭疽桿菌繁殖體或芽胞進入人體后，被吞噬細胞吞噬,，芽胞即復(fù)蘇繁殖,，產(chǎn)生外毒素并形成抗吞噬的莢膜。外毒素直接引起局部組織水腫,，出血,、壞死，并可引起全身毒血癥狀,?？雇淌傻那v膜則使細菌更易于擴散，引起導(dǎo)流的淋巴結(jié)出血壞死,，甚至侵入血流引起敗血癥,。如侵犯腦膜,，可致腦膜出血、水腫,。



 二,、炭疽的病理學(xué)變化

 根據(jù)感染途徑不同，人類炭疽分為皮膚炭疽,、吸入性炭疽和胃腸道炭疽3種主要原發(fā)病類型,。

 （一）皮膚炭疽

 主要發(fā)生在皮膚暴露部位，如手臂,、面頸,。當炭疽桿菌或芽胞從損傷的皮膚進入體內(nèi)后，首先在局部大量繁殖,，產(chǎn)生外毒素,，致局部皮膚水腫、出血,、組織壞死,。

 皮膚炭疽的潛伏期一般為2～3天（9h～12天），首先在局部出現(xiàn)小而癢的丘疹,，次日即見疹中心變成小水皰,，周圍組織腫脹，繼之,，中心部壞死,，形成一無痛性臍形潰瘍，直徑1～3cm,，潰瘍周圍環(huán)以水皰,，皰內(nèi)為漿液血性液體，含大量炭疽桿菌,。潰瘍的壞死組織與血性滲出物形成一特征性黑色痂皮,，特稱結(jié)痂（eschar）。病變部神經(jīng)纖維變性,，故局部無痛感,。潰瘍周圍組織水腫十分明顯。顯微鏡下,，局部顯著充血,，皮膚表層壞死，真皮水腫,、壞死,、出血，炎細胞反應(yīng)輕微,，或僅見輕度中性粒細胞浸潤,，或見血管炎，血管周圍單個核細胞浸潤,。局部可發(fā)生淋巴結(jié)腫大,、水腫出血、疼痛,。頭頸部的皮膚炭疽,，水腫常很快沿著軟組織擴散致頸、胸,、肩部,，甚者可致呼吸困難，這種廣泛水腫稱為惡性水腫,。一般黑痂形成數(shù)日后開始緩慢愈合,，2周后水腫可漸吸收，痂皮脫落,，80%可自然愈復(fù),。對皮膚炭疽禁忌切除，重癥病例可并發(fā)敗血癥或引起炭疽性腦膜炎,。



 圖7 皮膚炭疽

 左圖：面部炭疽,，下眼瞼潰瘍焦痂形成，眼瞼及面部水腫

 右圖：下肢炭疽,，下肢水腫,、潰瘍焦痂周圍繞以水泡



 潰瘍的滲出物內(nèi)有大量炭疽桿菌，取滲出物涂片作細菌染色有助于確診,。用Steiner染色,，炭疽桿菌呈黑色，用革蘭氏染色炭疽桿菌呈紫色,?？股刂委煟?5h，細菌仍較多,，治療超過72h,，細菌將明顯減少，革蘭氏染色可能為陰性,，此時可做免疫組化染色,。如應(yīng)用抗炭疽桿菌細胞壁抗體、抗炭疽桿菌莢膜抗體做免疫組化染色,。免疫組織化學(xué)檢查除能顯示細菌,，還能顯示細胞內(nèi)外的細菌碎片或顆粒狀抗原，有助于對經(jīng)過治療患者的確診,。

 （二）吸入性炭疽

 由吸入炭疽芽胞引起感染,，潛伏期尚未完全確定,，估計高劑量吸入潛伏期為1～6天，中位數(shù)為4天,。

 吸入的炭疽芽胞在肺內(nèi)立即被肺泡吞噬細胞吞噬,，幾小時之內(nèi)，被轉(zhuǎn)運至縱隔淋巴結(jié),，肺內(nèi)不遺留特異性炎癥,。早期胸部X線檢查均有異常，主要為縱隔增寬,、胸水或有肺部小的浸潤灶（水腫）,。尸檢可見縱隔、肺門和支氣管旁淋巴結(jié)呈急性充血,、出血,，有中性粒細胞浸潤和細胞碎片，并含有大量炭疽桿菌,，有的小血管內(nèi)可見新鮮血栓,，這些改變使淋巴結(jié)腫大，大者直徑達4～6cm,，淋巴結(jié)周圍的脂肪結(jié)締組織也可出現(xiàn)高度水腫,、充血、大片出血,，使整個縱隔呈膠凍樣水腫團塊,。胸膜也可水腫增厚，胸腔內(nèi)見有大量漿液血性積液,。肺泡內(nèi)可有不同程度的水腫,，局灶性透明膜形成。

 吸入性炭疽早期查痰無意義,。一般來說,，胸膜表面及胸腔積液內(nèi)含有大量炭疽桿菌，取胸水檢測可助于確診,。用抗生素治療3天以上,，革蘭氏染色常為陰性，此時可取胸水離心,，將細胞制成蠟塊,，用切片作免疫組化染色（用抗炭疽桿菌莢膜抗體或細胞壁抗體），可見桿菌片斷和顆粒狀抗原,。說明免疫組化染色在確診中較為重要,。此外，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）也可證實胸水中的炭疽桿菌。





 圖8 吸入性炭疽的病理改變

 A 縱隔出血水腫淋巴結(jié)出血腫大 B 縱隔軟組織出血

 C 縱隔淋巴結(jié)組織壞死,、核固縮 D 淋巴結(jié)可見免疫母細胞及固縮核



 吸入性炭疽可發(fā)生敗血癥,，脾臟充血腫大，脾髓內(nèi)含有大量的炭疽桿菌,。在肝竇,、枯否細胞、腸漿膜面及腸黏膜下血管內(nèi)均見炭疽桿菌抗原,。吸入性炭疽也可發(fā)生腦膜播散引起出血性腦膜炎，腦脊液（CSF）中培養(yǎng)出炭疽桿菌,。

 （三）胃腸炭疽

 在自然感染中,，胃腸道炭疽較多見，系由于食入炭疽桿菌污染嚴重的未熟肉類感染,。胃腸道炭疽分為2型：口咽型及胃腸型（腹型）,。

 1、口咽炭疽

 大多為單側(cè),，多數(shù)病變位于扁桃體,，也見于懸雍垂及軟腭。早期病變?yōu)榫植克[,、充血,，第一周末黏膜中心壞死，潰瘍形成,，第二周初潰瘍上可見假膜,。所有患者均有頸部腫脹，75%為單側(cè),，淋巴結(jié)腫直徑可達4 cm,。軟組織腫脹與淋巴結(jié)腫大同時存在可壓迫患者的呼吸道。曾有報道,，5例原診為扁桃體膿腫而行手術(shù)探查,，但沒有化膿。另有報道,，24例中3例死亡（死亡率13%）,，此3人的潛伏期均小于24h，提示感染更為嚴重,，血培養(yǎng)可為陰性,，咽拭子為陽性，說明咽拭子對口咽炭疽的確診甚為重要,，PCR及免疫組化染色也有助于診斷,。

 2、胃腸型炭疽

 因進食被炭疽桿菌污染的食物而發(fā)病，腸道病變通常位于回腸及盲腸,，腸壁水腫出血,、壞死，腸黏膜有潰瘍,，腸系膜淋巴結(jié)腫大,，伴或不伴有血性腹水，沾有血的糞便中可培養(yǎng)出炭疽桿菌,。





 圖9 盲腸升結(jié)腸水腫出血,，腸系膜淋巴結(jié)腫大





 臨床表現(xiàn)



 潛伏期：一般為1～5日，也有短至12h,，長至2周者,。

 隨炭疽桿菌侵入途徑及部位的不同，臨床上主要分為皮膚炭疽,、吸入性（肺型）炭疽和食入性（胃腸型）炭疽,。部分患者可發(fā)展為敗血癥、腦膜腦炎等重癥,，預(yù)后不好,。

 一、皮膚炭疽

 約占95%～98%,，病變多見于手,、腳、面,、頸,、肩等裸露部位皮膚。最初為皮膚破損部位（皮膚破損輕微時,，可無明顯傷口）出現(xiàn)斑疹或丘疹,，第2日在皮疹頂部出現(xiàn)小水皰而成皰疹，內(nèi)含淡黃色液體,，周圍組織變硬而腫脹,。第3～4日病變中心呈現(xiàn)出血性壞死、組織稍下陷,，周圍有成群小水泡,，水腫區(qū)繼續(xù)擴大。第5～7日壞死區(qū)潰破成淺潰瘍,，血樣滲出物結(jié)成硬而黑似炭塊狀焦痂,，痂下有肉芽組織生成。潰瘍直徑1～5cm不等,，其周圍皮膚浸潤及水腫范圍較大,，直徑可達5～20cm。由于局部末梢神經(jīng)受損而無明顯疼感和壓痛，有輕微癢感,，無膿腫形成,，這是皮膚炭疽的特點。以后隨水腫消退,，黑痂在1～2周內(nèi)脫落,，肉芽組織增生愈合緩慢。大多數(shù)病例為單灶性發(fā)病,，但個別病例可因抓撓病變部位而出現(xiàn)多處皰疹,，致自身感染。病程約1～6周,。

 皮膚炭疽發(fā)病同時,，多出現(xiàn)發(fā)熱（38℃～39℃）、頭痛,、關(guān)節(jié)痛、全身不適以及局部淋巴結(jié)和脾腫大等中毒癥狀和體征,。

 少數(shù)病例皮膚局部無水皰和黑痂形成而表現(xiàn)為大塊狀水腫,，患處腫脹透明、微紅或蒼白,，擴展迅速,，多見于眼瞼、頸,、大腿及手部等組織疏松處,。全身中毒癥狀嚴重，表現(xiàn)為高熱,、頭痛,、惡心、嘔吐,，若貽誤治療,，預(yù)后不良。



 圖10 吸入性炭疽患者的縱隔增寬



 二,、吸入性炭疽

 因暴露于芽胞或吸入污染芽胞塵埃所致,。急性起病。多在暴露后2～5天出現(xiàn)低熱,、疲勞和心前區(qū)壓迫等,，持續(xù)2～3天后，癥狀突然加重,，輕者表現(xiàn)為胸悶,、胸痛、發(fā)熱、咳嗽,、咯帶血黏液痰,。重者寒戰(zhàn)、高熱,、由于縱膈淋巴結(jié)腫大,、出血并壓迫支氣管造成呼吸窘迫、氣急喘鳴,、咳嗽,、紫紺、血樣痰等,，并可伴有胸腔積液,。肺部體征與病情常不相符。聽診肺部僅可聞及散在的細小濕羅音或有摩擦音,、呼吸音降低等胸膜炎體征,。X線檢查見縱隔增寬、胸水及肺部浸潤性陰影,。常并發(fā)敗血癥及腦膜炎,，若不能及時診斷、積極搶救,，患者多在急性癥狀出現(xiàn)1～2天內(nèi)發(fā)生感染中毒性休克,、呼吸衰竭或循環(huán)衰竭而死亡。

 三,、胃腸型炭疽

 主要由于食入未煮熟的被炭疽桿菌污染的病蓄的肉類食品而引起,，偶而可因飲入被炭疽病菌污染的水或牛奶而患病，與患者一起進食的人可相繼發(fā)病,。臨床上可表現(xiàn)為口咽部炭疽和胃腸道炭疽,。口咽部炭疽：表現(xiàn)為嚴重的咽喉部疼痛,，頜下及頸部明顯水腫,、局部淋巴結(jié)腫大，水腫壓迫食管引起吞咽困難,，壓迫氣管時可引起呼吸困難,。胃腸道炭疽：癥狀輕重不一，輕者惡心嘔吐,、腹痛,、腹瀉，但便中無血,，里急后重不明顯,，可于數(shù)日內(nèi)恢復(fù),。重者可表現(xiàn)為腹痛、腹脹,、腹瀉,、血樣便等急腹癥癥狀，易并發(fā)敗血癥和感染中毒性休克,。如不及時治療?？蓪?dǎo)致死亡。

 四,、其他臨床表現(xiàn)

 炭疽性敗血癥：吸入性炭疽,、胃腸型炭疽和嚴重的皮膚炭疽可繼發(fā)敗血癥，除局部癥狀加重外,，表現(xiàn)為全身毒血癥加重,，高熱、寒戰(zhàn),、衰竭等,。

 炭疽性腦膜炎：繼發(fā)于皮膚炭疽的病例小于5%。極個別病例可繼發(fā)于吸入性和胃腸型炭疽,。臨床表現(xiàn)為化膿性腦膜炎,，起病急驟，有劇烈頭痛,、嘔吐、昏迷,、抽搐,，明顯腦膜刺激癥狀，腦脊液多呈血性,，少數(shù)為黃色,，壓力增高，白細胞數(shù)及中性粒細胞增多,。病情發(fā)展迅猛,，常因誤診得不到及時治療而在發(fā)病后2～4日內(nèi)死亡。





 實驗室檢查



 一,、血常規(guī)檢查

 主要為白細胞計數(shù)升高,。一般為10～20×109/L，病情嚴重時高達60～80×109/L,。分類顯示中性粒細胞增高,，可達70%以上。

 二,、病原學(xué)檢查

 炭疽桿菌的病原學(xué)操作,，應(yīng)在生物安全二級實驗室中進行,。

 1、涂片及培養(yǎng)：采集皮膚潰瘍的滲出物,、排泄物,、血、胸腹水及腦脊液等標本進行涂片和培養(yǎng),。所采標本經(jīng)涂片,、革蘭氏及堿性美藍染色后行顯微鏡檢查，可觀察到大量兩端平齊,、呈長串聯(lián)狀排列的革蘭氏陽性桿菌,，菌體較大，周圍環(huán)繞莢膜,。陳舊培養(yǎng)物經(jīng)孔雀綠芽胞染色可見到大量的細菌芽胞,。

 莢膜染色：在玻片上涂組織液，或莢膜菌培養(yǎng)物,，自然干燥,。置純甲醇或乙醇中固定1min，取出晾干,。滴加多色美藍染料染色3～5min,，在次氯酸鹽中脫色。水洗,，吸干,，油鏡觀察。菌體呈現(xiàn)藍色,，莢膜呈現(xiàn)紅色,。

 所有標本都應(yīng)立即涂片，染色,，進行顯微鏡檢查,。隨后進行細菌培養(yǎng)。

 2,、PCR檢測：在正常的無菌標本（如血液,、腦脊液）涂片鏡檢中，未發(fā)現(xiàn)大量均一的革蘭氏陽性桿菌,，而僅依靠細菌分離培養(yǎng)才能獲得可疑的炭疽桿菌的細菌時,，應(yīng)盡可能進行PCR檢測?？芍苯邮褂门R床標本進行檢測,，也應(yīng)對分離獲得的培養(yǎng)物檢測，標本可經(jīng)沸水浴10min處理,，或經(jīng)蛋白酶K消化,，并使用碘化鈉-玻璃粉吸附以富集DNA,。

 推薦檢測質(zhì)粒上的保護性抗原基因（pag），莢膜形成基因（cya）和染色體上的炭疽桿菌特異基因（ropB）,。推薦的引物序列為：pag: F:5’-ATTTGCGGTAACACTTCACT-3’, R:5’-AGACCGTGACAATGATGGAA-3’,； cya: F:5’-CGGATTGTATATGGAGTGGG-3’,

 R:5’-GGGACAGGAATGTTTGGATC-3’； ropb: F:5’-GTACGCCAATCGATATCATG-3’,

 R:5’-GATCATCGTCATCTTCCG TA-3’,。 PCR反應(yīng)體系為50μl,，包括下列成分：10×反應(yīng)緩沖液，5μl,；4×dNTP混合物（每種2.5mM）,， 4μl；引物（上游）,，1μl,，引物（下游），1μl,；內(nèi)部對照模板,，1μl；待測模板,，1μl,；無菌去離子水，36.75μl,；Taq DNA 聚合酶,，1ｕl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min,，1個循環(huán),，之后95℃ 1 min，55℃ 1 min,，72℃1 min。30個循環(huán),。最后72℃延伸5 min,。結(jié)果分析：采用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，讀膠儀檢測,。由于PCR技術(shù)有時會出現(xiàn)交叉污染和假陽性反應(yīng),，應(yīng)采取抗污染的PCR擴增方法，并對檢測結(jié)果進行必要的PCR產(chǎn)物序列測定,，以排除污染,。



 【標本采集時注意事項】

 此操作規(guī)范應(yīng)在生物安全二級實驗室內(nèi)進行。采集的標本不得用解剖的方式獲取,。所需的血液與組織標本,，均應(yīng)以穿刺方式取得,。盡可能在抗生素治療開始前采取標本。根據(jù)炭疽病例的不同型別酌情采集病灶標本,。

 1,、皮損部位標本的采集：皮膚炭疽水泡期時，注意無菌操作,，以無菌棉簽從未破潰水泡內(nèi)沾取水泡液（水泡期內(nèi)以革蘭氏染色法較易發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌）,；在結(jié)痂期時，收集焦痂組織時需小心提起外層的焦痂組織,，以無菌棉簽取焦痂組織轉(zhuǎn)動棉簽2～3 s,，以保證有足夠的標本。

 2,、血培養(yǎng)：無菌條件下采集全血5～10ml,。

 3、糞便：運送大便標本應(yīng)注意放置在清潔,、干燥,，無菌和密閉的容器內(nèi)，標本應(yīng)大于5 g,。對部分無法收集糞便標本的患者,，可以肛試子插入肛門1英寸采取標本。

 4,、痰培養(yǎng)：收集痰標本應(yīng)大于1ml,，應(yīng)以無菌密封容器運送。無痰液者,，應(yīng)取培養(yǎng)基,、打開平皿蓋，將積液置于距離患者口鼻10cm處,；令患者對平皿咳嗽,，然后迅速蓋上平皿。

 5,、其他體液標本：胸腔積液或腦脊液等標本,，按照規(guī)定的程序穿刺取得。

 6,、尸體標本：患者死于炭疽時,，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質(zhì)臟器獲得組織標本。

 【標本運輸及儲存】

 1,、拭子：室溫直接運輸至實驗室,，如運輸時間超過1h，在2～8℃運輸,。

 2,、糞便：1h內(nèi)運輸新鮮大便至實驗室,，如運輸時間超過1h，在2～8℃運輸,。

 3,、痰液：以無菌有蓋的容器常溫運送，如運輸時間超過1h,，在2～8℃運輸,。

 4、血培養(yǎng)標本：室溫直接運輸至實驗室,。

 【標本培養(yǎng)的操作】

 按標準操作程序進行,。

 所有污染的和陳舊的標本，均應(yīng)首先制成懸液,。根據(jù)標本中含炭疽桿菌量的多少,，可將懸液適當稀釋，或經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后,，再以10000 g/min離心5min,，取富集的沉淀物。將所得的懸液沸水浴加熱15min后涂布平板,。

 培養(yǎng)過程：適宜溫度35℃～37℃,；環(huán)境氣體：潔凈空氣或少量CO2。培養(yǎng)周期,，至少培養(yǎng)3天,，每日觀察，在培養(yǎng)18～24h內(nèi)即可開始觀察,，少數(shù)炭疽桿菌在培養(yǎng)8h后即生長,。

 菌落特點：一般在SBA培養(yǎng)平板培養(yǎng)15～24h，生長完好的菌落大約直徑2～5mm,。菌落呈平或不規(guī)則的突起,，邊緣略不規(guī)則，毛玻璃外觀,，菌落邊緣有“逗號”形,，顯微鏡下觀察邊緣呈明顯 “獅頭樣”菌落。

 血平板上炭疽桿菌不溶血,，過度生長的菌落有輕微溶血,，但與β溶血鏈球菌有明顯區(qū)別,。

 需對照觀察在SBA和MAC培養(yǎng)基的生長,，因炭疽桿菌在SBA培養(yǎng)基生長良好而在MAC培養(yǎng)基不生長。

 炭疽桿菌生長迅速,，接種濃度高的局部,，6～8h可以看到菌落生長,，個別或可在12～15h內(nèi)看到菌落生長，利用這一特性,，可以將炭疽桿菌與其它生長較慢的細菌進行區(qū)分,。

 炭疽桿菌鑒定：

 含上述可疑菌落取出，劃線接種于平板之上,，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴1滴診斷用炭疽噬菌體,，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8～24h后,，在噬菌體處有透明噬菌斑,，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環(huán)，便可判定接種物為炭疽桿菌,。



 三,、免疫學(xué)檢查

 在從患者標本中未獲得炭疽桿菌陽性和分離結(jié)果的情況下，可依據(jù)血清學(xué)檢驗結(jié)果確定對患者的診斷,。

 首份血清應(yīng)在首次檢視患者時采取,，通常應(yīng)一次采取血液標本供涂片鏡檢、細菌分離培養(yǎng),、血清學(xué)抗體檢查及常規(guī)的血液檢查使用,。血清分離后置4℃保存，應(yīng)在5天內(nèi)完成檢測,。如超過5天,，應(yīng)放置于-20℃冰箱保存?；謴?fù)期血清應(yīng)在發(fā)病后15天左右采取,。

 恢復(fù)期血清應(yīng)在發(fā)病后15日左右采取。

 （一）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗,，檢測患者血液內(nèi)炭疽桿菌保護性抗原的抗體,，試驗方法如下。

 1,、滴定板包被：所用各孔加入炭疽桿菌保護性抗原（PA）液（0.3μg/ml）100 μl,，酶標板貼上封口膜，置4℃過夜,。次日,，棄孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100 μl,，洗滌3次,，每次3 min。

 洗滌緩沖液配方為：



 Tris 2.42 g

 1 M HCl 13 ml

 Tween-20（0.05％） 0.5 ml

 加蒸餾水至 1000 ml







 2、待檢血清：樣本的初篩：每孔加入100 μl待測血清,，按倍比稀釋（稀釋液為生理鹽水）至1∶8,，置37℃ 60 min。棄孔內(nèi)溶液,，每孔加洗滌緩沖液100 μl,，洗滌3次，每次3 min (同時做空白,、正常血清對照) ,。復(fù)判：每份陽性血清做雙復(fù)孔檢測其滴度，增加測定結(jié)果的可分析性,。

 3,、耦聯(lián)酶標記：于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的工作濃度的辣根過氧化物酶標記SPA 或抗人IgG100 μl，酶標板貼上封口膜,，置37℃ 60 min,。棄孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100 μl,，洗滌3次,，每次3 min。

 4,、顯色：于各反應(yīng)孔中加入等體積混合的顯色底物A,、B溶液100 μl，酶標板貼上封口膜,，置暗處20 min,。于各反應(yīng)孔中加入顯色終止液（0.5 M H2SO4）100 μl終止反應(yīng)。

 底物A液（磷酸鹽檸檬酸緩沖液,，pH5.0）配方為：



 0.2 M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7 ml

 0.1 M檸檬酸(19.2克／L) 24.3 ml

 H2O2 0.1%

 蒸餾水 50 ml







 底物B液（TMB〈四甲基聯(lián)苯胺〉使用液）配方為：



 TMB 3.90 g

 檸檬酸 10.52 g

 EDTA 1.86 g

 甘油 2000 ml

 DMSO 300 ml

 加熱溶解后加蒸餾水至 10000 ml





 5,、結(jié)果判斷：實驗結(jié)果可用酶標儀判讀，被檢孔吸光度（A）值達陰性血清對照孔OD值的2.1倍時,，可判斷為陽性,。



 注：技術(shù)說明

 ⑴ 在從患者標本中未獲得炭疽芽胞桿菌陽性和分離結(jié)果的情況下，可依據(jù)血清學(xué)檢測結(jié)果,，確定對患者的診斷,。

 ⑵ 目前多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行炭疽特異性抗體檢測，一般用捕捉法進行,，即酶標板孔用適量炭疽毒素抗原包被,，加入100μL待檢血清后，經(jīng)洗滌加入工作濃度的辣根過氧化物酶標記的SPA或抗人IgG,，再經(jīng)洗滌后用酶標儀判讀,，被檢孔A值高于陰性對照孔≥2.1倍時,，可判斷為陽性。

 ⑶ 雙份血清標本：患者首份血清應(yīng)在首次檢視患者時采取,，通常應(yīng)一次采取血液標本供涂片鏡檢，細菌分離培養(yǎng),，血清學(xué)抗體檢查及常規(guī)的血液檢查使用,，血清分離后置4℃保存，待獲得恢復(fù)期血清后,，一同進行抗體檢查,。恢復(fù)期血清應(yīng)在患者發(fā)病后15日左右采取,。

 ⑷ 試劑盒：應(yīng)有國家有關(guān)機構(gòu)頒發(fā)的應(yīng)用許可證,。





 診 斷



 一、流行病學(xué)資料

 在炭疽的診斷中占有重要地位,，了解患者職業(yè),、工作和生活情況，如與食草動物密切接觸的農(nóng),、牧民及皮毛,、皮革加工工人；在疫區(qū)生活或可能施放生物武器的環(huán)境中停留和接觸的可疑物者,。需要注意的是,，流行病學(xué)調(diào)查可能無法發(fā)現(xiàn)接觸史，而在受到生物攻擊的情況下,，可疑的接觸史可能與自然感染完全不同,。因而流行病學(xué)線索不是診斷的必需條件。

 二,、臨床表現(xiàn)

 典型皮膚炭疽的皮損特點（具有黑痂的淺潰瘍,，周邊有小水皰，附近組織較為廣泛的非凹陷性水腫）而無明顯疼痛感覺,。發(fā)生吸入性炭疽時可突發(fā)寒戰(zhàn),、高熱、呼吸困難,、紫紺等,；發(fā)生胃腸型炭疽時可出現(xiàn)急性腹瀉、急腹癥等表現(xiàn),。

 三,、臨床檢驗

 外周血象白細胞總數(shù)及中性升高，在分泌物,、組織液和排泄物等標本中,，涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)大量、均一的革蘭氏陽性粗大的桿菌，為臨床診斷最有力的證據(jù),。吸入性炭疽時胸部X線表現(xiàn)貧乏,，與沉重的臨床表現(xiàn)不相稱，主要表現(xiàn)為縱隔增寬,、胸膜炎癥,、肋膈角變鈍、胸腔積液及胸膜刺激表現(xiàn)等,。綜合考慮以上三方面因素,，可作出本病的臨床診斷。

 四,、微生物檢驗

 檢出具有毒力的（即通過PCR檢驗pag和cya基因均為陽性）的炭疽桿菌,，或者恢復(fù)期血清中針對炭疽桿菌毒素的抗體較急性期血清升高4倍以上，可作出本病的確切診斷,。





 鑒別診斷



 患者的職業(yè),、工作和生活狀況，對本病的診斷和鑒別診斷有重要的參考價值,。

 一,、皮膚炭疽

 1、皮膚感染及蜂窩織炎：癰,、癤和蜂窩織炎均為局部皮膚感染而有局部紅腫熱痛,，重者亦伴有全身中毒癥狀，血白細胞亦可明顯增高,。鑒別點：①局部疼痛明顯,，皮損處無焦痂及周圍水腫；而皮膚炭疽局部形成焦痂,，周圍明顯水腫,，病灶處呈壞死出血而非化膿性炎癥特點，但局部無明顯疼痛,，此為重要鑒別點,。②引起病變之致病菌不同，局部取材做涂片及培養(yǎng)可得不同細菌,。

 2,、恙蟲病：亦可有局部皮膚損害及焦痂,，亦伴有發(fā)熱及頭痛等癥狀,。鑒別點：①去過該病疫區(qū)，而無病畜接觸史,。②伴皮疹及肝脾腫大,。③白細胞正常,。④血清學(xué)檢查外斐反應(yīng)變形桿菌OXx凝集試驗大于l