• 【發(fā)布單位】國家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【發(fā)布文號】國食藥監(jiān)注[2006]639號
• 【發(fā)布日期】2006-12-19
• 【生效日期】2006-12-19
• 【失效日期】--
• 【文件來源】國家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【所屬類別】政策參考

抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

(國食藥監(jiān)注[2006]639號)





各省,、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：



 為科學(xué)規(guī)范和指導(dǎo)藥物研究工作,，保證藥物研究質(zhì)量,，國家局組織制定了《抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,、《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》等4個研究技術(shù)指導(dǎo)原則,，現(xiàn)予發(fā)布，請參照執(zhí)行。



 附件：1．抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則?

 2．手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則?

 3．藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則?

 4．細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則





 國家食品藥品監(jiān)督管理局

 二○○六年十二月十九日





抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則



 一,、 概述



 艾滋病的全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征”（Acquired immunodeficiency syndrome,，AIDS）,，它是由艾滋病病毒,，即“人類免疫缺陷病毒”（Human immunodeficiency virus，HIV）感染而導(dǎo)致的一種傳染性疾病,。



 HIV在分類學(xué)上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科 (Retroviridae),、慢病毒屬 (Lentivirus)、靈長類慢病毒群 (Primate lentivirus group),。HIV分為二型：HIV-1和HIV-2,。HIV-1為全球性流行，HIV-2主要流行于非洲少數(shù)國家,。HIV-1較HIV-2 有更強的傳播和致病能力,。由于目前的研究和治療經(jīng)驗主要針對HIV-1，本指導(dǎo)原則主要涉及抗HIV-1的藥物,。根據(jù)目前的認(rèn)識,，HIV感染人體的靶細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的CD4+淋巴細(xì)胞，HIV的復(fù)制過程分為融合進(jìn)入,、基因逆轉(zhuǎn)錄,、基因整合、基因表達(dá),、病毒組裝及釋放等階段,，抗HIV藥物研究的靶點主要針對上述幾個階段。



 本指導(dǎo)原則介紹了抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究的一般原則和主要內(nèi)容,，還收載了抗HIV體內(nèi)外藥效學(xué)研究的一般方法等,，供研發(fā)者參考。本指導(dǎo)原則主要涉及抗HIV的化學(xué)藥物,，不包括中藥,、生物制品、預(yù)防用藥和免疫調(diào)節(jié)劑等,。



 本指導(dǎo)原則根據(jù)目前的認(rèn)知提出一些觀點和建議,，旨在引導(dǎo)和推動我國該類藥物非臨床藥效學(xué)研究與評價的發(fā)展，并幫助研發(fā)者理解對臨床試驗和/或臨床應(yīng)用有重要意義的數(shù)據(jù),，并非強制性要求,。研發(fā)者可根據(jù)品種的具體特點和基礎(chǔ)研究情況，采用其他適宜的方法,，但應(yīng)對采用的方法及其可靠性進(jìn)行說明,。



 二、 一般原則



 1、不同的抗HIV藥物作用機制不同,，各有特點,，可根據(jù)具體情況確定藥效學(xué)研究的內(nèi)容和順序。



 2,、體外藥效學(xué)研究是闡明藥物具有抗HIV作用的基礎(chǔ),，是抗HIV藥物研究與評價的基本內(nèi)容。



 3,、體內(nèi)藥效學(xué)研究對于進(jìn)一步說明藥物的抗病毒作用,、指導(dǎo)臨床試驗有重要的參考價值。



 4,、應(yīng)闡明藥物作用的主要靶點或病毒復(fù)制的階段,，在此基礎(chǔ)上鼓勵進(jìn)行深入的作用機制研究。



 5,、HIV具有高度的變異性,，極易產(chǎn)生耐藥性。耐藥性研究有助于確定藥物的臨床適用范圍,，鼓勵進(jìn)行該項研究,。



 6、聯(lián)合用藥的體外藥效學(xué)研究對抗HIV藥物的臨床應(yīng)用配伍有一定的提示作用,，可視具體情況考慮進(jìn)行此項研究,。



 三、 主要研究內(nèi)容



 1,、 體外藥效學(xué)研究



 HIV可以在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)完成復(fù)制周期,。在進(jìn)行臨床試驗前，應(yīng)對藥物和/或其主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行可定量的體外抗病毒活性研究,，以證明藥物的抗病毒效果,，從而支持藥物進(jìn)入臨床試驗,。體外抗病毒活性研究得到的劑量－效應(yīng)關(guān)系可以指導(dǎo)臨床試驗劑量的選擇,。由于HIV具有高度的變異性,，體外抗病毒活性研究應(yīng)使用具有代表性的HIV毒株，特別是應(yīng)在原代人外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）/HIV 臨床分離株培養(yǎng)系統(tǒng)中驗證其抗HIV活性,。



 體外藥效學(xué)試驗需要首先確定一個沒有細(xì)胞毒性的藥物濃度,，以便在細(xì)胞培養(yǎng)模型上區(qū)分藥物的抗病毒活性和藥物導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。應(yīng)在藥物濃度逐漸增加的情況下使用定量試驗測定HIV復(fù)制的情況并與沒有藥物存在的情況進(jìn)行比較,。治療指數(shù)（Therapeutic index, TI）是評價藥物體外抗HIV活性的最重要指標(biāo),。體外藥效學(xué)研究就是要在不同細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，測定藥物對HIV臨床分離株和實驗室適應(yīng)株的抗病毒活性,，分別計算出治療指數(shù),。具體試驗方法可參考附錄中的相關(guān)內(nèi)容,。



 藥物對HIV的有效抑制濃度應(yīng)與作用機理提示的數(shù)據(jù)一致。如果藥物抑制HIV復(fù)制的濃度低于作用機理研究所提示的濃度,，提示可能存在其他作用靶點或機理,。



 血清蛋白可以結(jié)合并屏蔽很多藥物，從而影響藥物的抗病毒活性,。建議對血清蛋白結(jié)合率高的藥物進(jìn)行血清蛋白存在情況下的體外抗病毒活性研究,。



 聯(lián)合用藥是目前臨床抗HIV治療的基本原則，主要目的是減少或延緩耐藥性毒株的產(chǎn)生,。推薦與已經(jīng)上市的,、具有不同作用機理,、作用靶點和代謝特征的藥物進(jìn)行聯(lián)合抗病毒活性研究,，這對于確定臨床聯(lián)合用藥方案具有一定的提示作用。



 2,、 體內(nèi)藥效學(xué)研究



 目前尚缺乏理想的HIV感染動物模型,，但體內(nèi)藥效學(xué)研究對于進(jìn)一步說明藥物的抗病毒作用、指導(dǎo)臨床試驗仍有重要的參考價值,。目前可供評價抗HIV藥物體內(nèi)有效性的動物模型主要有二種：（1）猴艾滋病毒（Simian immunodeficiency virus,，SIV）感染模型：SIV與HIV-1、HIV-2同屬慢病毒,，可感染恒河猴,、食蟹猴等。該模型既可考察藥物在體內(nèi)對病毒復(fù)制的抑制作用,，又可觀察給藥后免疫功能重建的情況,。（2）人淋巴組織重建的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型（Sever combined immunodeficient-human，SCID-hu）：將人外周血淋巴和單核細(xì)胞或胸腺組織移植給SCID小鼠,，然后感染HIV,。



 盡管SIV感染模型與人艾滋病感染的病毒不同，其發(fā)病機理,、臨床表現(xiàn),、病毒學(xué)及免疫學(xué)特征等也有差異，但SIV和HIV均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科,，有較高的核苷酸序列同源性,，具有相同的生活周期。SIV可選擇性地攻擊猴的CD4+細(xì)胞,，猴感染SIV后出現(xiàn)與人艾滋病相似的發(fā)病過程和病理特征,，是目前用于評價抗HIV藥物相對較好的動物模型。SCID-hu小鼠模型也可用于抗HIV藥物的體內(nèi)藥效學(xué)研究,，但需嚴(yán)格的飼養(yǎng)條件,。



 動物感染模型給藥后觀察的指標(biāo)包括：（1）病毒學(xué)指標(biāo)：病毒滴度,、病毒抗原量以及病毒載量，耐藥性病毒的分離和鑒定等,。（2）免疫學(xué)指標(biāo)：CD4+/ CD8+細(xì)胞數(shù),、淋巴細(xì)胞功能等。（3）臨床指標(biāo)：癥狀,、發(fā)病率和死亡率,。（4）組織病理學(xué)指標(biāo)： 組織病理學(xué)變化。具體試驗方法可參考附錄一中的相關(guān)內(nèi)容,。



 3,、作用機理研究



 由于目前尚缺乏理想的HIV感染動物模型，體外抗病毒活性與人體內(nèi)實際情況的相關(guān)性又具有一定的局限性,，作用機理研究對于進(jìn)一步闡明藥物的抗HIV作用,、確定藥物的臨床治療定位和聯(lián)合用藥方案具有重要的意義，對預(yù)測藥物的毒性和闡明耐藥產(chǎn)生的機理也是有價值的,。作用機理研究包括：（1）確定藥物特異性抑制病毒復(fù)制或病毒特定功能的能力,。（2）確定藥物作用的靶點，例如：病毒融合進(jìn)入,、逆轉(zhuǎn)錄酶,、整合酶、蛋白酶等,。



 除上述基本的機理研究以外,，還可以采用生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué),、細(xì)胞學(xué),、遺傳學(xué)等方法進(jìn)一步研究藥物對病毒的受體結(jié)合、酶活性,、結(jié)合活性,、蛋白剪切加工、病毒顆粒裝配等方面的作用,；測定藥物的X－射線晶體結(jié)構(gòu),、分析作用靶點的耐藥性基因變異特征等。另外還應(yīng)通過對病毒和細(xì)胞/宿主蛋白靶點的研究證明藥物作用的特異性,，特別是在細(xì)胞內(nèi)有病毒酶類似物存在的情況下,。例如，如果藥物作用于HIV多聚酶,，相對于宿主細(xì)胞的DNA多聚酶（例如DNA多聚酶α, β, γ）,，藥物對HIV多聚酶的活性應(yīng)更為顯著。



 4,、耐藥性研究



 鼓勵創(chuàng)新性抗HIV藥物進(jìn)行耐藥性研究,。在研究中應(yīng)重點關(guān)注兩方面的問題：一方面是藥物對HIV耐藥毒株是否有抗病毒活性,，另一方面是藥物是否容易誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的基因型和表型耐藥性特性。



 四,、 結(jié)語



 非臨床藥效學(xué)研究與評價是抗HIV藥物評價的重要組成部分,，對于該類藥物的臨床試驗與臨床定位有重要的提示價值。在尚無理想的動物模型的情況下,，應(yīng)更加重視體外藥效學(xué)研究與評價,。鼓勵進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)研究，盡可能提供有提示價值的相關(guān)研究資料,。



 抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究應(yīng)按照藥物研發(fā)的客觀規(guī)律分階段持續(xù)地進(jìn)行,，在進(jìn)行臨床試驗前提供必要的、足夠的有效性提示信息,，在臨床試驗和臨床應(yīng)用過程中還應(yīng)根據(jù)實際情況和需要進(jìn)行深入研究,。



 由于抗HIV藥物研究與評價是一項不斷發(fā)展和探索的課題，本指導(dǎo)原則也將隨著研發(fā)和認(rèn)知水平的提高不斷修訂和完善,。



 五,、 參考文獻(xiàn)



 1,、 FDA：Guidance for Industry：Antiviral Drug Development ― Conducting Virology Studies and Submitting the Data to the Agency（DRAFT GUIDANCE）. 2005.5



 2,、 FDA：Guidance for Industry：Role of HIV Drug Resistance Testing in Antiretroviral Drug Development(DRAFT GUIDANCE）.2004.12



 3、 抗人免疫缺陷病毒（HIV-1）藥藥效學(xué)指導(dǎo)原則草案,，蔣巖等,，1999



 4、 中藥新藥治療艾滋病非臨床有效性研究與評價專題會紀(jì)要,，藥審中心,，2005.3



 六、 著者



 《抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組





 附錄一：

 抗HIV藥物非臨床藥效學(xué)研究的一般方法



 HIV可用傳代人T淋巴細(xì)胞或原代人外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng),，T嗜性的病毒株可導(dǎo)致人T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變,，如細(xì)胞融合、多核巨細(xì)胞等,。M嗜性的病毒株一般不導(dǎo)致細(xì)胞病變,，可通過檢測培養(yǎng)上清液的HIV p24抗原、病毒RNA或逆轉(zhuǎn)錄酶活性監(jiān)測病毒復(fù)制的情況,。體外藥效學(xué)試驗一般應(yīng)重復(fù)三次,。



 目前尚缺乏理想的HIV感染動物模型，常采用替代模型或經(jīng)過改造的小動物模型來評價藥物的體內(nèi)抗HIV活性,，如感染猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus,，SIV）或嵌合病毒（Simian/human immunodeficiency virus ，SHIV）的猴模型和感染HIV的人淋巴組織重建的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型(Sever combined immunodeficient-human,，SCID-hu),。



 本附錄收入了目前較成熟和常用的抗HIV體外,、體內(nèi)藥效學(xué)試驗方法，供研發(fā)者參考,。今后可根據(jù)研究進(jìn)展情況進(jìn)一步修訂,。



 一、體外藥效學(xué)試驗



 1,、病毒和細(xì)胞



 （1）病毒：應(yīng)盡可能選擇多種生物學(xué)表型和基因型的病毒株,，包括HIV實驗室適應(yīng)株和有代表性的HIV臨床分離株。在進(jìn)行抗HIV耐藥性毒株的藥效學(xué)研究時,，應(yīng)選用耐藥性毒株,；對于明確作用靶點的藥物，應(yīng)首先選擇對該作用靶點藥物耐藥的毒株,。



 （2）細(xì)胞：應(yīng)盡可能選擇多種細(xì)胞,。常用的有傳代人T淋巴細(xì)胞系（如CEM、MT4,、MT2,、C8166、H9等）,、單核巨噬細(xì)胞系（如U937等）和活化的人原代外周血單個核細(xì)胞（PBMC）,。



 （3）病毒感染劑量的確定：測定HIV的感染劑量一般采用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上微量培養(yǎng)滴定的方法，通過觀察細(xì)胞病變或檢測病毒標(biāo)記物,，如HIV p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶等,，計算出病毒的感染性滴度（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，50% Tissue culture infectious dose,， TCID50）,。在不同的細(xì)胞系/病毒株培養(yǎng)系統(tǒng)，使用的病毒感染劑量不盡相同,，一般選用100～1000TCID50,。



 2、藥物的細(xì)胞毒性測定：將不同濃度的藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,，在特定條件下培養(yǎng)一定時間,，用適宜的方法測定活細(xì)胞的比例，計算藥物對細(xì)胞的毒性（半數(shù)細(xì)胞毒性濃度,，Median toxic concentration,，TC50）。



 3,、抗HIV活性測定：



 （1）試驗分組



 空白對照組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞,。



 陽性對照組：陽性對照藥與病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng)。陽性對照藥一般選擇與受試藥物作用靶點相同的臨床有效藥物,。



 陰性對照組：藥物溶媒與病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng),。



 病毒對照組：病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng),。



 藥物對照組：受試藥物與細(xì)胞共同培養(yǎng)。



 試驗組：受試藥物與病毒和細(xì)胞共同培養(yǎng),。



 （2）感染和給藥方法：一般采用藥物,、病毒、細(xì)胞同時培養(yǎng)的方式,，也可以根據(jù)藥物作用的靶點采取藥物先與HIV作用再加細(xì)胞,、藥物先與細(xì)胞作用再加HIV或HIV先感染細(xì)胞再加藥物的感染和給藥方式。



 （3）監(jiān)測指標(biāo)和方法：



 細(xì)胞病變：在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),，觀察有無HIV特征性的細(xì)胞病變（合胞體以及細(xì)胞融合）,。



 HIV抗原：用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中的HIV p24 抗原濃度。



 逆轉(zhuǎn)錄酶：用同位素?fù)饺牖蚱渌椒z測培養(yǎng)上清液的逆轉(zhuǎn)錄酶活性,。



 根據(jù)細(xì)胞病變觀察,、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶檢測的結(jié)果，計算藥物對病毒的抑制活性（半數(shù)抑制濃度,，Median inhibition concentration, IC50）,。



 4、藥效學(xué)評價指標(biāo)



 由于病毒的存活與復(fù)制依賴于宿主細(xì)胞,，而抗病毒藥物本身有一定的細(xì)胞毒性,，因此不能僅以細(xì)胞病變、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶活性作為藥效學(xué)評價的指標(biāo),，而應(yīng)以治療指數(shù)（TI）為主要的評價指標(biāo),。一般認(rèn)為治療指數(shù)大于10的藥物可能具有體外抗HIV活性。



 5,、藥物的聯(lián)合抗HIV活性測定



 將2～3種不同的藥物加入到同一實驗體系中，按照前述的方法監(jiān)測病毒的抑制情況,，判斷藥物對病毒的聯(lián)合作用,。實驗中除了設(shè)置一般體外藥效學(xué)研究需要的對照以外，還應(yīng)有各單藥對照,。聯(lián)合抗HIV活性測定的數(shù)據(jù)分析方法比較復(fù)雜,，需采用特定的模型和軟件。



 二,、體內(nèi)藥效學(xué)試驗



 1,、SIV感染猴模型



 （1） 病毒：SIV毒株，靜脈注射或粘膜感染,。



 （2） 動物：恒河猴,、食蟹猴等，體重5公斤左右,，動物數(shù)應(yīng)滿足評價的要求,，一般每組4～6只,。



 （3） 病毒感染劑量的測定：可采用兩種方法，一種方法是用保存的毒種在體外感染猴淋巴細(xì)胞,，初步確定病毒的感染劑量,。一般選擇三個劑量組，每組間10倍稀釋,，每個稀釋度接種兩只猴,，感染后不同時間取血，通過細(xì)胞培養(yǎng)測定病毒滴度,，并定量檢測SIV RNA,，以兩只猴均感染的最小劑量作為最小感染量（Monkey infectious dose，MID100）,。另一種方法是用感染猴的血漿接種猴,，感染后每周取血測定SIV抗原和細(xì)胞培養(yǎng)病毒，計算半數(shù)感染量（Median infectious dose, ID50）,。



 （4） SIV感染猴治療試驗：



 急性感染治療試驗：猴靜脈注射10～100ID50 或5MID100 的SIV,，同時或4小時后口服或注射最大無毒劑量以下2倍遞減2個劑量的藥物，每天給藥,，連續(xù)8周,。每周取血，培養(yǎng)病毒,，測定SIV p27抗原滴度和SIV RNA,，計算保護(hù)百分率，并與病毒對照組進(jìn)行比較,。給藥前,、停藥當(dāng)天和停藥后8周進(jìn)行淋巴結(jié)檢查，觀察免疫系統(tǒng)的病理改變,。另外,，還要測定CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/ CD8+比值,。



 慢性感染治療試驗：猴靜脈注射10～100ID50或5～10MID100 的SIV,，感染后60天左右開始給藥，一般試驗組在最大無毒劑量以下2倍遞減2個劑量,。每天給藥,，連續(xù)8周。于給藥前,、給藥第8周,、停藥當(dāng)天和停藥后8周取血，測定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，計算保護(hù)百分率,，并與病毒對照組進(jìn)行比較,。給藥前、停藥當(dāng)天,、停藥后8周進(jìn)行淋巴結(jié)檢查,，觀察免疫系統(tǒng)的病理改變。另外,，還要測定CD4+,、CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/ CD8+比值。



 2,、HIV感染SCID-hu小鼠模型



 （1）動物：SCID小鼠,，4～8周齡，雌性,，靜脈注射人PBMC或移植人胚胸腺/肝臟組織,。



 （2） HIV感染劑量測定：將HIV細(xì)胞培養(yǎng)上清液10倍連續(xù)稀釋5個濃度，靜脈注射或移植組織注射感染小鼠,。1周后取小鼠的血液,、脾、淋巴結(jié)和腹腔洗液,，定量培養(yǎng),，測定病毒滴度，HIV p24抗原,、病毒載量,，計算ID50。



 （3）藥物毒性測定：SCID-hu小鼠灌服或靜脈注射給藥,，測定急性毒性和亞急性毒性,，計算半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）和最大耐受量（0% Lethal dose, LD0）。



 （4）HIV感染SCID-hu小鼠藥物治療試驗：SCID-hu小鼠腹腔注射10～100ID50 HIV,，2～24小時后灌服或靜脈注射給藥,。感染1周后，取血液,、脾、淋巴結(jié)和腹腔洗液,，定量培養(yǎng),，測定病毒滴度，HIV p24抗原,、病毒載量,，計算抑制率和半數(shù)有效劑量（Median effective dose, ED50），并與病毒感染對照組進(jìn)行比較,。





 附錄二：

 耐藥性研究的相關(guān)問題



 考察藥物對HIV耐藥性毒株是否有抗病毒活性,，至少應(yīng)該評價對相同作用靶點的耐藥性毒株的抗病毒活性,，所選用的耐藥性毒株應(yīng)該經(jīng)過全面的鑒定。由于抗HIV藥物已經(jīng)有很多種,，交叉耐藥性是臨床上的一個重要問題,，因此應(yīng)關(guān)注藥物對于相同作用靶點有耐藥性的病毒的抗病毒活性，及已上市藥物對受試藥物誘導(dǎo)的耐藥毒株的抗病毒活性,。耐藥毒株的試驗結(jié)果可提示藥物用于該類耐藥株的臨床有效性,。



 考察藥物是否容易導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的生物學(xué)特性，可在體外進(jìn)行耐藥毒株的誘導(dǎo)試驗,，以確定藥物是否容易導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的基因型和表型特征,，并檢驗交叉耐藥性。



 有些藥物的遺傳閾值比較低,，病毒基因發(fā)生1～2個點突變就可產(chǎn)生耐藥性,，而有些藥物的遺傳閾值比較高，需要多個基因位點的突變才能產(chǎn)生耐藥性,?？刹捎脙煞N方法誘導(dǎo)藥物的耐藥毒株：（1）病毒在固定的藥物濃度下連續(xù)傳代，可使用多個不同藥物濃度的培養(yǎng)系統(tǒng),，這種方法對于遺傳閾值低的藥物比較有效,；（2）病毒在逐漸增加藥物濃度的情況下連續(xù)傳代培養(yǎng)，藥物濃度從IC50值的一半起始,，監(jiān)測病毒復(fù)制的情況并誘導(dǎo)出耐藥毒株,。



 用基因型和表型方法對誘導(dǎo)出的耐藥毒株進(jìn)行鑒定?；蛐头治隹梢源_定哪些基因突變導(dǎo)致HIV對藥物的敏感性下降,，主要方法是對HIV基因組中藥物作用的靶基因進(jìn)行核酸序列測定，并與野生毒株的靶基因序列進(jìn)行比較,。對傳代過程中不同代次的毒株進(jìn)行序列測定可確定多個突變出現(xiàn)的先后順序,。表型耐藥性分析能夠確定突變的病毒是否對藥物的敏感性下降以及下降的程度。耐藥性相關(guān)基因突變的確定有助于使用重組病毒系統(tǒng)評估這些突變導(dǎo)致的表型耐藥性,，也就是使用定點誘變系統(tǒng)或PCR方法擴增病毒基因組相應(yīng)的部分引入這些特定的突變,，以便檢測重組病毒在體外對藥物的敏感性；也可以采用在含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法,，通過測定HIV抗原,、HIV RNA、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶,、細(xì)胞毒性或報告基因的表達(dá)等確定IC50值并與參考毒株的IC50進(jìn)行比較,，以IC50增加的倍數(shù)作為衡量表型耐藥性的指標(biāo)。





 附錄三：

 名詞解釋



 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50%Tissue culture infectious dose ,TCID50）：是使50%細(xì)胞感染的病毒稀釋度。



 半數(shù)有效量（Median effective dose）：是能引起50%陽性反應(yīng)或50%最大效應(yīng)的濃度或劑量,，分別用半數(shù)有效濃度（EC50）,、半數(shù)抑制濃度（IC50）或半數(shù)有效劑量（ED50）表示。如果效應(yīng)指標(biāo)為毒性或死亡,，則可改為半數(shù)毒性濃度（TC50）,、半數(shù)毒性劑量（TD50）或半數(shù)致死濃度（LC50）、半數(shù)致死劑量（LD50）表示,。



 治療指數(shù)（Therapeutic index, TI）：藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的效力與抑制病毒復(fù)制的效力的比值（50%細(xì)胞毒性濃度/50%有效抑制濃度,，TC50/IC50），



 半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗條件下引起50%動物死亡的劑量,。



 最大耐受量（0% Lethal dose, LD0）：不引起受試動物死亡的最高劑量,。