• 【發(fā)布單位】國家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【發(fā)布文號】國食藥監(jiān)注[2005]493號
• 【發(fā)布日期】2005-10-14
• 【生效日期】2005-10-14
• 【失效日期】--
• 【文件來源】國家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【所屬類別】政策參考

結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則

結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則

(國食藥監(jiān)注[2005]493號)





各省、自治區(qū),、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：



 為規(guī)范疫苗研發(fā)行為,，指導(dǎo)疫苗研究單位科學(xué)地開展研究工作，根據(jù)《藥品管理法》,、《藥品管理法實施條例》及《藥品注冊管理辦法》,，我局組織制定了《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導(dǎo)原則》,、《聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,、《多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則》、《結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《預(yù)防用疫苗臨床試驗不良反應(yīng)分級標準指導(dǎo)原則》等6個技術(shù)指導(dǎo)原則,，現(xiàn)印發(fā)給你們,，并請轉(zhuǎn)發(fā)轄區(qū)內(nèi)各有關(guān)單位。



國家食品藥品監(jiān)督管理局

二○○五年十月十四日





結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則



 前 言



 結(jié)合（以蛋白為載體的細菌多糖類）疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖-蛋白結(jié)合疫苗,，用于提高細菌疫苗多糖抗原的免疫原性,，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等,。結(jié)合疫苗的生產(chǎn)及質(zhì)量控制應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定和中國藥品GMP要求,。其制造及檢定方法的標準操作規(guī)范、驗證和修訂應(yīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準或認可,。



 本原則適用于多糖-蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制和臨床研究,。



 應(yīng)根據(jù)疫苗生產(chǎn)用菌種的生物安全防護等級分類,，在相應(yīng)的生物安全防護條件下進行各項生產(chǎn)用菌種的操作。生產(chǎn)操作和質(zhì)量檢驗人員必須經(jīng)過嚴格的職業(yè)培訓(xùn),，并應(yīng)采取適宜的防護措施,，例如免疫接種相應(yīng)的疫苗。必須制訂詳細的和切實可行的緊急處理措施,，確保一旦發(fā)生細菌溢出,、滲漏等其它細菌播散事故時，可最大限度地控制和避免危害人身和環(huán)境的安全,。



 一,、結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制原則

 （一）多糖抗原生產(chǎn)的質(zhì)量控制

 1．生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基：生產(chǎn)用菌種須經(jīng)國家食品藥品管理當局批準方可用于制備多糖抗原。應(yīng)采用種子批系統(tǒng),。從原始種子批傳代,、擴增后凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批,。主種子批和工作種子批菌種的各種特性應(yīng)與原始種子批一致,。工作種子批用于生產(chǎn)。應(yīng)驗明各級菌種庫菌種的記錄,、來源,、歷史和生物學(xué)特性，并進行各項必需的生物學(xué)特性鑒定,。如：形態(tài),、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗等,。必要時可采用核磁共振（1H或13C）,、核苷酸序列分析等特殊鑒定方法。

 培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能避免使用動物源性材料,，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料,。

應(yīng)通過監(jiān)測細菌的生長速度、pH值和多糖的產(chǎn)量,，保證不同批或不同培養(yǎng)罐中細菌生長的均一性,。

 應(yīng)在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行純菌試驗，可采用革蘭氏染色鏡檢和平皿劃線接種培養(yǎng)等,。若發(fā)現(xiàn)染有雜菌應(yīng)廢棄,。



 2．精制純化多糖：精制純化多糖應(yīng)逐批進行鑒別試驗、純度和分子大小測定,。應(yīng)制定多糖純度的合格標準,。通常應(yīng)在－20℃以下儲存精制純化后的多糖，以維持其穩(wěn)定性,。為控制精制純化多糖的質(zhì)量所進行的測定包括：

 （1）鑒別試驗：通常應(yīng)用血清學(xué)反應(yīng)進行多糖鑒別試驗,；

 （2）分子大小分布：應(yīng)采用凝膠過濾或高效液相色譜（HPLC）等適宜方法測定純化多糖的分子大小分布,，并建立相應(yīng)的KD 值合格標準，不同批純化多糖的KD 值應(yīng)保持一致,；

 （3）采用凍干保存的純化多糖,其水分含量應(yīng)合格,；

 （4）多糖含量：應(yīng)采用特定的方法測定糖含量，如磷含量測定,、唾液酸含量測定和核糖含量測定等方法；

 （5）雜蛋白含量：應(yīng)采用Lowry 法,、BCA法等方法測定純化多糖中蛋白雜質(zhì)的含量,，應(yīng)同時采用相應(yīng)的國家標準品作蛋白測定對照；

 （6）核酸雜質(zhì)含量：應(yīng)采用紫外260nm測定等方法測定純化多糖中核酸雜質(zhì)含量,；

 （7）應(yīng)采用家兔熱原試驗或鱟試驗定量測定方法測定純化多糖中的熱原質(zhì)及內(nèi)毒素含量,；



 3．修飾處理后的多糖：多糖與載體蛋白結(jié)合前通常需先經(jīng)化學(xué)修飾，即活化（例如可采用溴化氰活化多糖）,。應(yīng)采用適宜的方法檢測化學(xué)修飾的效果, 即活化度測定,；另外，可采用凝膠過濾或高效液相色譜等適宜方法測定活化后多糖的分子大小分布,，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應(yīng)的批間一致性,。



 （二）載體蛋白的質(zhì)量控制

 載體蛋白生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則與多糖抗原生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則相同。



 結(jié)合疫苗常用的載體蛋白包括有：破傷風類毒素,、白喉毒素無毒變異蛋白（CRM197）和B群腦膜炎球菌外膜蛋白等,。



 如果采用已有國家標準的破傷風類毒素和白喉類毒素等作為載體，其各項質(zhì)量指標應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的要求,，尤其要注意確保載體蛋白的純度,。

 采用國外已通過臨床試驗驗證的安全有效的CRM197 蛋白、B群腦膜炎球菌外膜蛋白等作為載體,，應(yīng)參照國外相應(yīng)的質(zhì)量標準,，對其特性和純度進行質(zhì)量復(fù)核：（1）可采用HPLC法等適宜方法測定CRM197 蛋白的純度，其純度應(yīng)在90% 以上,；應(yīng)確保CRM197 蛋白的氨基酸序列正確無誤,。如果與白喉類毒素在同一車間生產(chǎn)，應(yīng)建立能區(qū)分CRM197 蛋白和白喉毒素的方法,，并應(yīng)符合中國藥品GMP要求,。（2）可采用SDS-PAGE 圖譜分析測定純化后B群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物的組成；其脂多糖的含量不應(yīng)超過8%,；家兔熱原試驗應(yīng)合格,。



 采用上述以外的其它蛋白作為載體，應(yīng)參照上述蛋白載體質(zhì)量標準要求,，結(jié)合其自身特點建立相應(yīng)的質(zhì)量標準,，并進行嚴格的質(zhì)量檢測和復(fù)核,。



 可采用血清學(xué)方法進行載體蛋白的鑒別試驗。用于檢測載體蛋白理化特性的常用方法包括：SDS-PAGE 圖譜分析,、等電聚焦分析,、HPLC測定、氨基酸分析,、氨基酸序列分析,、旋光度測定、熒光分光光譜分析,、肽圖譜分析和質(zhì)譜分析等,。



 如果載體蛋白與多糖結(jié)合前需進行活化處理，應(yīng)建立測定蛋白活化程度的方法,，以確保批與批之間的一致性,。



 （三）多糖-蛋白結(jié)合物原液的質(zhì)量控制

 不同的結(jié)合疫苗可能采用不同的多糖-蛋白結(jié)合工藝，但均需要進行多步反應(yīng),。為了確保多糖-蛋白結(jié)合物的穩(wěn)定性,、安全性和批間一致性，應(yīng)建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法,。由于結(jié)合反應(yīng)可能影響多糖的結(jié)構(gòu),，多糖-蛋白結(jié)合后（單價結(jié)合物未混合前）應(yīng)進行多糖的鑒別試驗。此外,，還應(yīng)對純化后的多糖-蛋白結(jié)合物進行以下檢測：



 1．應(yīng)采用適宜的檢測方法,，確證多糖-蛋白結(jié)合物原液經(jīng)過純化后，多糖-蛋白結(jié)合反應(yīng)中所使用的試劑（如溴化氰,、ADH和EDAC等化學(xué)試劑）已被清除,；



 2．如果化學(xué)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生了獨特的結(jié)合標志（例如某一獨特的氨基酸），可通過測定該標志物定量分析多糖―蛋白結(jié)合反應(yīng)的程度,，也可將結(jié)合物中多糖/蛋白比作為判斷結(jié)合反應(yīng)的一個間接標志,；



 3．殘留的活化功能基團：結(jié)合物中多糖或載體蛋白均應(yīng)不再殘留有活化后未結(jié)合的功能基團；



 4．結(jié)合及未被結(jié)合的多糖含量：結(jié)合多糖為結(jié)合疫苗中的免疫保護抗原,。未被結(jié)合的游離多糖不得超過一定比例,。可直接測定游離多糖的含量,，或先將結(jié)合多糖和未結(jié)合多糖分離后測定結(jié)合多糖的含量,。將結(jié)合多糖和游離多糖分離的方法包括沉淀、凝膠過濾,、超濾或超離等方法,；



 5．蛋白含量：可采用HPLC等適宜方法測定多糖-蛋白結(jié)合物中結(jié)合蛋白和未結(jié)合蛋白的含量；



 6．多糖/蛋白比：分別測定結(jié)合物中結(jié)合多糖和結(jié)合蛋白的含量；



 7．分子大小分布：結(jié)合物原液應(yīng)逐批進行相對分子大小的測定,，可采用凝膠過濾或液相色譜等方法進行測定,，所建立的方法應(yīng)能將多糖-蛋白結(jié)合物與未結(jié)合的多糖、蛋白區(qū)分開,；



 8．無菌試驗應(yīng)合格,；



 9．結(jié)合物中載體蛋白的毒性試驗：如果采用破傷風類毒素和白喉類毒素作為載體蛋白，應(yīng)按現(xiàn)行版《 中國藥典》的要求,，對多糖-蛋白結(jié)合物進行破傷風類毒素和白喉類毒素的毒性試驗,；



 10．可對結(jié)合物進行熱原試驗及內(nèi)毒素含量測定。

 疫苗原液在稀釋,、分裝前可加入適宜和適量的佐劑,、防腐劑及保護劑。多價結(jié)合疫苗既可在各單價結(jié)合物原液混合后加入佐劑,、防腐劑及保護劑，也可在各單價結(jié)合物原液中加入佐劑,、防腐劑及保護劑后再混合,。稀釋分裝前無菌試驗應(yīng)合格。



 （五）成品的質(zhì)量檢定

 1．鑒別試驗：通常采用多糖的特異性抗體進行免疫學(xué)測定,；



 2．無菌試驗：成品中不得檢出細菌或真菌等微生物,；



 3．多糖含量：可采用化學(xué)顯色、色譜分析（包括HPLC）或符合國家規(guī)定的免疫學(xué)方法（例如速率比濁法或ELISA）進行測定,；



 4．殘留水分：如果結(jié)合疫苗為凍干制品,，應(yīng)采用適宜方法測定水分，殘余水分應(yīng)不超



 5．毒素含量：可采用家兔熱原試驗或鱟試驗定量測定內(nèi)毒素含量,；



 6．佐劑含量：如果疫苗使用了佐劑,，應(yīng)采用適宜的方法檢測成品中佐劑的含量，所使用的佐劑及其用量應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定,。如果所使用的佐劑為鋁佐劑,，每人用劑量中的佐劑含量應(yīng)不超過1.25mg；



 7．防腐劑含量：選擇防腐劑時應(yīng)該考慮防腐劑的穩(wěn)定性,，應(yīng)避免選擇可能與疫苗成分產(chǎn)生相互作用的防腐劑,。如果疫苗中加入了防腐劑，應(yīng)采用符合國家規(guī)定的方法測定成品中防腐劑的含量,。所加入的防腐劑及其含量應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定,，即應(yīng)不破壞疫苗的免疫效果，也

不會損害人體健康,；



 8．異常毒性試驗,，應(yīng)符合現(xiàn)行版《 中國藥典》的要求；



 9．pH值測定：pH值對結(jié)合疫苗的穩(wěn)定性、安全性及免疫保護效果影響很大,，應(yīng)根據(jù)臨床研究和穩(wěn)定性試驗的結(jié)果確定最適pH值范圍,。成品應(yīng)逐批進行pH值測定，凍干制品應(yīng)采用批準的稀釋劑復(fù)溶后進行pH值測定,；



 10．外觀檢查應(yīng)符合規(guī)定要求,；



 11．稀釋劑：應(yīng)對復(fù)溶疫苗用稀釋劑進行檢定。必須采用疫苗生產(chǎn)廠家提供的,、符合國家規(guī)定的稀釋劑,。



 （六）其他

 結(jié)合疫苗的包裝、標簽,、配送,、運輸和儲存均應(yīng)符合中國藥品GMP要求及國家有關(guān)規(guī)定。

 結(jié)合疫苗的標簽上應(yīng)標明：每一人用劑量中所含多糖抗原（血清群,、型別）和載體蛋白,；每一人用劑量中每一結(jié)合物的含量；儲存和運輸?shù)倪m宜溫度（2-8℃）,；如果疫苗為凍干疫苗,，應(yīng)標明疫苗復(fù)溶后應(yīng)迅速接種；凍干疫苗應(yīng)標明疫苗復(fù)溶所采用的稀釋劑名稱及體積,。穩(wěn)定性試驗應(yīng)考慮的因素包括：結(jié)合疫苗逐漸解聚的特性,，導(dǎo)致多糖分子量變小、與蛋白載體結(jié)合的多糖含量減少,、結(jié)合物分子變小以及游離多糖含量增加,。加速穩(wěn)定性試驗的結(jié)果不能替代實時穩(wěn)定性試驗。如果生產(chǎn)工藝的改變可能影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性,，應(yīng)進行穩(wěn)定性試驗對新方法進行驗證,。



 二、結(jié)合疫苗的臨床研究

 為評價結(jié)合疫苗的安全性和免疫原性,，應(yīng)按國家規(guī)定的要求進行結(jié)合疫苗的臨床研究,。由于結(jié)合疫苗（尤其是多價結(jié)合疫苗）生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜，影響因素較多,，出現(xiàn)批間差異的可能性相對較大,。因此，多價結(jié)合疫苗宜采用多批疫苗進行臨床研究,。如果生產(chǎn)工藝發(fā)生重大改變,，或是將多價疫苗作為一種新聯(lián)合疫苗的組分時，應(yīng)考慮重新進行臨床研究,。



 如果結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝或劑量,、劑型發(fā)生了變化,，應(yīng)及時向國家食品藥品監(jiān)督管理局報告，由國家食品藥品監(jiān)督管理局根據(jù)具體情況組織專家進行再評估,，評估的內(nèi)容包括：發(fā)生的變化是否會影響結(jié)合疫苗的質(zhì)量,、批間一致性、結(jié)構(gòu)完整性和免疫原性,。應(yīng)考慮到多個細微改變可能產(chǎn)生的累積效應(yīng),。



 必要時，結(jié)合疫苗的臨床研究中可設(shè)置多糖疫苗對照組,。如果偶聯(lián)疫苗的適應(yīng)證包括載體蛋白來源細菌所導(dǎo)致的疾病,，可設(shè)置載體菌疫苗對照組。



 應(yīng)采用適宜的血清學(xué)標準評估結(jié)合疫苗的免疫保護效果,，應(yīng)對測定IgG抗體所采用的方法進行標準化,，從而驗證其功能抗體與IgG抗體的相關(guān)性，此外,，還可通過臨床研究,，證明結(jié)合疫苗能誘導(dǎo)多糖疫苗無法誘導(dǎo)的免疫記憶反應(yīng)。