• 【發(fā)布單位】農(nóng)業(yè)部
• 【發(fā)布文號(hào)】公告第2078號(hào)
• 【發(fā)布日期】2014-03-12
• 【生效日期】2014-03-12
• 【失效日期】--
• 【文件來(lái)源】農(nóng)業(yè)部
• 【所屬類(lèi)別】政策參考

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2078號(hào)

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2078號(hào)


    根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》和《獸藥注冊(cè)辦法》規(guī)定,，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測(cè)定法,，現(xiàn)予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行,。
    特此公告,。
    附件：1.口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法
          2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
農(nóng)業(yè)部
  2014年3月12日
 
附件1
口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘,，然后在4℃條件下,，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml,，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》一部附錄進(jìn)行檢驗(yàn),。每頭份疫苗中內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于50 EU,。
附件2
口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫，在3個(gè)1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,，充分混勻，室溫放置10分鐘,，在4℃條件下,，以15000g離心15分鐘。吸棄液相,，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次,，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶后,，按附注進(jìn)行檢驗(yàn),。每毫升疫苗總蛋白含量應(yīng)不高于500μg。
附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
1.方法與原理
本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測(cè),。本法系福林酚法(lowry法),，依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原,，產(chǎn)生藍(lán)色化合物,，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸,、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比,，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量,。
2.試劑與儀器
2.1試劑丙酮（分析純）,、無(wú)菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；
2.2設(shè)備酶標(biāo)儀（全波長(zhǎng)），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器,，單通道和多通道移液器,，渦旋震蕩儀,，酶標(biāo)板振蕩器等。
3.操作步驟
3.1標(biāo)準(zhǔn)系列稀釋液制備將商品化試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/ml母液）,，按下表依次稀釋,。



 
編號(hào)
 
 
1
 
 
2
 
 
3
 
 
4
 
 
5
 
 
6
 
 
7
 
 
8
 
 
9
 


 
母液（μl）
 
 
0
 
 
5
 
 
25
 
 
50
 
 
100
 
 
150
 
 
200
 
 
300
 
 
400
 


 
去離子水（μl）
 
 
400
 
 
395
 
 
375
 
 
350
 
 
300
 
 
250
 
 
200
 
 
100
 
 
0
 


 
終濃度（μg/ml）
 
 
0
 
 
25
 
 
125
 
 
250
 
 
500
 
 
750
 
 
1000
 
 
1500
 
 
2000
 



3.2檢驗(yàn)疫苗處理取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，在3個(gè)1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,，充分混勻,，室溫放置10分鐘,，在4℃條件下,，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次,，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶備用。
3.3反應(yīng)板加樣與讀數(shù)
3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液40μl，以及三重復(fù)待檢疫苗樣品40μl,，分別加入到96孔板內(nèi),。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內(nèi)試劑，立即用振蕩器混勻30秒,；
3.3.2封膜,，室溫孵育10分鐘；
3.3.3各孔內(nèi)分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內(nèi)為2倍,，用前用去離子水現(xiàn)稀釋）,，立即用振蕩器混勻30秒；
3.3.4封膜,，室溫孵育30分鐘；
3.3.5酶標(biāo)儀測(cè)定750nm吸光值,，保存讀數(shù),。
3.4數(shù)據(jù)處理
根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸,，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為Y軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)趨勢(shì)線求得多項(xiàng)式,，其多項(xiàng)式R2≥0.98,。
將被檢樣品的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得的多項(xiàng)式，計(jì)算樣品中蛋白含量,，根據(jù)取樣量求得1ml樣品中蛋白含量,。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時(shí),，100μl疫苗經(jīng)丙酮沉淀后用50μl去離子水復(fù)溶,，測(cè)得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度,。結(jié)果判定時(shí),，將測(cè)定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量,。
3.5結(jié)果判定
若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定,；若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg,，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。
3.6檢測(cè)數(shù)據(jù)處理舉例
3.6.1收集數(shù)據(jù)如表所示



 
Value
 
 
1
 
 
2
 
 
3
 
 
4
 
 
5
 
 
6
 
 
7
 
 
8
 
 
9
 
 
10
 
 
11
 
 
12
 


 
A
 
 
0.102
 
 
0.149
 
 
0.336
 
 
0.504
 
 
0.836
 
 
1.122
 
 
1.334
 
 
1.702
 
 
1.923
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
B
 
 
0.677
 
 
1.722
 
 
0.252
 
 
1.116
 
 
2.167
 
 
1.020
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
C
 
 
0.640
 
 
1.704
 
 
0.230
 
 
1.050
 
 
2.195
 
 
0.962
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
D
 
 
0.641
 
 
1.716
 
 
0.225
 
 
1.061
 
 
2.175
 
 
1.012
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
E
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
F
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
G
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 


 
H
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 
 
--
 



上述表格中,，A1-A9為系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液,，A1至A9蛋白濃度依次增高；B,、C,、D行中1-6列為檢測(cè)樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品,，每一列為同一疫苗樣品三個(gè)重復(fù),。
3.6.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將上表中數(shù)據(jù)復(fù)制到EXCELL表格中，



 
Value
 
 
1
 
 
2
 
 
3
 
 
4
 
 
5
 
 
6
 
 
7
 
 
8
 
 
9
 


 
OD750
 
 
0.102
 
 
0.149
 
 
0.336
 
 
0.504
 
 
0.836
 
 
1.122
 
 
1.334
 
 
1.702
 
 
1.923
 


 
蛋白濃度μg/ml
 
 
0
 
 
25
 
 
125
 
 
250
 
 
500
 
 
750
 
 
1000
 
 
1500
 
 
2000
 



采用EXCEL程序,，選中1-9列對(duì)應(yīng)的兩行數(shù)據(jù)→“插入”→“散點(diǎn)圖”,，選擇“帶平滑線和數(shù)據(jù)標(biāo)記的散點(diǎn)圖”，得到以750nm吸光值為X軸,，以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢(shì)線”→“其他趨勢(shì)線選項(xiàng)”,，選中“多項(xiàng)式”,、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可信,。每一塊96孔板應(yīng)設(shè)一組標(biāo)準(zhǔn)并繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

3.6.3數(shù)值計(jì)算
以樣品測(cè)定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,，Y為蛋白濃度,，以表中第一批疫苗測(cè)定結(jié)果為例。該疫苗三重復(fù)測(cè)定的OD750數(shù)據(jù)（X）分別為：0.677,、0.640,、0.641，代入公式計(jì)算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml,、306μg/ml,、307μg/ml，該數(shù)據(jù)為每毫升水相抗原中總蛋白含量,。計(jì)算三重復(fù)數(shù)值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml,，標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV.P）為13.1，變異系數(shù)為4.15%（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量,，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量,，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法,，可計(jì)算其他樣品的總蛋白含量。
3.6.4結(jié)果判定
同一樣品不同重復(fù)間變異系數(shù)應(yīng)小于5.3%,，否則試驗(yàn)不成立,，應(yīng)重做,。若測(cè)定值小于或等于500μg/ml,，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定,；若測(cè)定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定,。